Acte 1
Dans la forêt de Fontainebleau.
Don Carlo, l’infant d’Espagne, est venu en France sans trahir son identité afin de pouvoir observer discrètement la fille du roi de France qu’il est censé épouser pour mettre un terme à la guerre qui oppose les deux puissances ennemies. Il rencontre Élisabeth dans la forêt.

Tous deux tombent immédiatement amoureux l’un de l’autre. Ils ignorent que Philippe II, père de Don Carlo, a fait le choix d’épouser lui-même la jeune Élisabeth. Alors que le peuple se réjouit de la fin de la guerre, Élisabeth est contrainte d’accepter son sort inattendu. Don Carlo ne peut dissimuler sa détresse.

Acte 2
Carlo se recueille au monastère de Saint-Just, tombeau de l’empereur Charles Quint. Il croit reconnaître la voix de l’empereur, son grand-père, dans celle d’un moine. Toujours obsédé par son amour perdu, il confie son désespoir à Rodrigue, marquis de Posa, son ami d’enfance, de retour des Pays-Bas, états soumis à la violente occupation espagnole. Rodrigue lui conseille de s’éloigner de la cour et de partir avec lui défendre la cause des Flamands. Alors que le roi et la reine se recueillent sur la tombe de Charles Quint, les dames d’honneur d’Élisabeth et la princesse d’Eboli s’amusent aux portes du couvent.

Rodrigue convainc Élisabeth de revoir Carlo. Il espère qu’elle saura persuader le roi qu’il est en mesure de pacifier la Flandre. Leur rencontre laisse éclater l’ardeur toujours brûlante de leur amour passé mais Élisabeth rappelle à l’infant qu’elle est désormais sa mère. Carlo s’enfuit alors qu’arrive le roi qui s’étonne de voir la reine seule, ce qui est contraire à l’étiquette.

Philippe chasse de la cour la dame de compagnie de la reine, renvoie les courtisans qui l’accompagnent et reste seul avec Posa, lequel profite de l’occasion pour plaider la cause des Flamands. Le roi, séduit par la liberté et l’indépendance de Rodrigue, se laisse aller aux confidences et exprime à demi‑mots ses doutes sur la relation qui unit son fils et la reine. Il lui conseille également de se méfier de l’Inquisition.

Acte 3
Une fête est organisée la veille du couronnement de Philippe. La reine préfère ne pas s’y rendre et propose à la princesse d’Eboli d’échanger avec elle ses vêtements afin de pouvoir s’éclipser furtivement. La princesse, secrètement amoureuse de Carlo, lui a donné rendez-vous dans les jardins de la reine. Croyant reconnaître Élisabeth, Carlo lui adresse des mots passionnés qu’Eboli prend d’abord pour elle. Détrompée, elle comprend l’amour de Carlo pour la reine et, folle de jalousie, menace de les dénoncer. Rodrigue, qui a assisté à la scène, intervient et menace violemment Eboli.

Comprenant la gravité du danger, il conseille alors à Carlo de lui remettre les papiers compromettants qu’il pourrait avoir en sa possession. Le peuple acclame son roi, les moines et l’Inquisition en appellent à la damnation des infidèles pendant les préparatifs d’un autodafé. À la tête d’une délégation de députés du Brabant et de la Flandre, Carlo, hors de tout protocole et sans en avoir averti Rodrigue, se jette aux pieds de Philippe afin qu’il écoute leur requête. Le roi s’insurge et les traite d’infidèles. Carlo tire alors l’épée contre son père.

Personne n’ose intervenir sinon Rodrigue qui, voulant éviter le pire, désarme et fait arrêter Carlo stupéfait par ce qu’il considère être une trahison de son ami. Philippe annonce que Rodrigue est élevé au rang de duc. La cérémonie se termine par la mise à mort d’un hérétique.  

Acte 4 
Enfermé dans une sombre solitude, le roi, jaloux, se désespère du rejet d’Élisabeth et de l’attitude de son fils. Il sollicite l’avis du Grand Inquisiteur : peut-il condamner à mort son propre fils ? Dieu sacrifia le sien, lui répond-il. Et de demander également que Philippe lui remette Rodrigue que le Grand Inquisiteur accuse d’avoir des idées dangereuses et subversives.

Lors d’un dur échange, le roi refuse de lui donner son nouvel et inespéré ami. La reine demande justice à son époux pour le vol de son coffret à bijoux. Stupéfaite, elle le découvre en possession de Philippe qui l’ouvre devant elle en l’accusant ouvertement d’adultère car s’y trouve le portrait de Carlo que celui-ci lui avait remis à Fontainebleau. La reine s’évanouit face à la violence de l’accusation. Restée seule avec la reine, la princesse d’Eboli, gagnée par le remords, lui avoue avoir volé elle-même le coffret pour la faire accuser.

Elle confesse non seulement ses sentiments pour Carlo mais lui révèle aussi qu’elle a été la maîtresse du roi. Élisabeth lui laisse le choix entre l’exil ou le couvent. Rodrigue rend visite à Carlo dans sa prison et lui déclare qu’il sera prochainement libéré. Il lui affirme qu’on a trouvé chez lui les documents compromettants que Carlo lui avait remis. À ceux-ci, il en a ajouté d’autres qui ne peuvent que prouver au roi que le seul coupable est bien lui, Rodrigue. Un coup de feu éclate. Rodrigue, touché à mort, s’écroule. Il a le temps de dire à l’infant qu’Élisabeth l’attendra le lendemain au monastère de Saint-Just. À la vue du corps de Rodrigue, le roi, qui venait libérer son fils et concéder son erreur, est bouleversé et se lamente sur celui qui l’avait sorti de sa solitude. Il tente de se rapprocher de son fils mais celui-ci le repousse avec mépris. Le peuple furieux, ameuté par Eboli, envahit la prison pour délivrer Carlo. Mais l’intervention du Grand Inquisiteur sème la terreur et le peuple s’incline finalement devant Dieu et le roi.

Acte 5 
Élisabeth, dévastée de douleur, prie devant le tombeau de Charles Quint et demande la paix dans la mort. Carlo vient lui faire ses adieux avant son départ pour la Flandre. Leur ultime et bouleversant entretien est interrompu par l’arrivée du roi et du Grand Inquisiteur.

Celui-ci accuse Carlo de trahison et ordonne son arrestation mais l’infant est entraîné par un moine dans les profondeurs du cloître. Le roi et le Grand Inquisiteur restent frappés de stupeur en croyant reconnaître à leur tour la voix de Charles Quint.